Sál v paláci svatého Rood. Říká, že město má nepokoje. Někdo, kdo ho neznal v čele davu - mumři, maskovaní, tanečníci se zvonky, lidé v černých kapucích - ohrožoval, předpovídal a nutil lidi, aby neposlouchali královnu. Soudce královny Riccio potvrzuje, že také čas od času sleduje, jak lidé dychtivě naslouchají těmto kázáním. Tato stránka dále říká, že lidé vtrhli do královny kaple a křičeli: „Hnízdo papežů!“, Že buvolec Darnleyho, manžel královny, vyskočil na oltář a začal předstírat, že je kázání, a lidé mu odpověděli výsměšnými dvojverší. Královna Mary Stuart v zoufalství. Cítí nenávist k lidu, většina dvořanů ji opustila; přemýšlí, jak se její křesťanství může lišit od křesťanství skotského lidu. Riccio navrhuje okamžitě připravit vyhláška trestající osoby odpovědné za nepokoje. Maria diktuje svou stránku, stránka objasňuje, zda zadat jméno Heinricha Darnleyho, manžela královny. Mary váhá; ona má podezření, že nepokoje byly inspirovány jím - přece jen byl dav veden královskou buffoon. Zde jí Riccio připomíná, že je královnou; je jako slunce a má právo trestat od Boha. Žádá, aby okamžitě zavolal služebního důstojníka, aby oznámil královské nařízení. Douglas vstoupí. Maria mu řekne, aby vzal novinu královskému kancléři Mortonovi, aby to otiskl. Douglas prohlédne dekret a zjistí, že nemá jméno krále. Zeptá se na to královny. Riccio je za ni zodpovědná. Douglas ztrácí náladu. Naléhá na královnu, aby nepoužila krvavá opatření k potlačení, naznačuje, že to vidí jako francouzský nebo italský vliv. Královna mu však chladně připomíná její sílu eliminovat subjekty neposlušné její vůli. Mezi Ricciom a Douglasem vypukne hádka, Douglas vyzve Riccia k souboji a přísahá, že zítra zabije benátské. Královna odejde a vezme Riccia pryč. Douglas zůstává sám, zvažuje duel. Morton vstoupí. Douglas mu ukazuje dekret. Morton je nerozhodný: bojí se hněvu krále i královny. Morton králi nabídl, aniž by to razil. V této době byl Henry zapojen do rozhovoru se svým šaškem Nickem, který ho škádl s tím, že královna má skutečnou moc ve Skotsku, a Henry je jen její manžel, že si královna vybere blízké, například tohoto italského harfisty Riccia ... V tuto chvíli Morton přináší nešťastné rozhodnutí. Král v hněvu se rozhodne zabít Riccia. Král Lindsay vstoupí na soud a volá krále, aby lovil s nově získaným sokolem. Morton odpovídá, že král má dnes okupaci. Lindsay se dobrovolně připojí ke spiknutí proti Riccio. Doslova dnes zakazuje zabíjet Riccia, protože ho musí zítra ráno zabít. Potom Henry, využívající zpoždění, pošle šašek astrologovi, aby zjistil, jaké je umístění hvězd pro jeho úmysly.
Astrolog ve své laboratoři (je také alchymista) tvrdí sám se sebou, že zkušenost potvrzuje marnost vědy, tento účel, vůle hvězd dominuje člověku, zbavuje se dobra a zla. Nick vstoupí, posype se witticismem, astrolog není k němu vtipný. Nick hlásí, že ho král poslal, aby se zeptal na Riccioho osud, a řekne astrologovi, aby předpověděl Riccioho smrt. Astrolog odpovídá, že hvězdy mu řeknou, ne lidem, a zase předpovídá smrt šaška. S tím odchází. Objeví se stránka královny způsobená astrologem. Page miluje svou milenku. Astrolog mu říká, aby královně řekl, že dnes muž, kterého miluje, zemře. "Jak dnes Botwell zemře?" - vykřikuje stránku. Astrolog je zmatený. Měl na mysli Riccio a spěchá na stránku, aby ho na to varoval. Vlevo sám, astrolog se diví - také se ukázalo z hvězd, že Botwell byl nějak temně spojen s královnou - přes Mars, Saturn ... Botwell vstoupí. Z jeho monologu je zřejmé, že se neočekávaně ocitl v domě astrologa. Když si uvědomil, kde se dostal, Botwell se ptá astrologa, kolik mu zbývalo žít. Starý muž odpovídá, že tři roky a že Botwell bude králem. Botwell vytáhne láhev jedu, se kterou chtěl spáchat sebevraždu, chce ji zahodit - a váhat. Opravdu, v atmosféře palácových intrik se každá zbraň hodí. Odchází.
Tato stránka říká královně, že Riccio přijde brzy. Královna se na něj těší - podle jejího názoru jí zůstal věrný sám. "A Botvel?" Stránka se zeptá. "Kdo je Botvel?" - královna má zájem. Překvapená stránka vypráví Mary, jak při plavbě silným větrem vytáhl z hlavy královny růže a do vody spadl květ. A pak jeden z dvořanů - Botvel - vběhl do člunu a strašidelně pronásledoval veslař, aby chytil růži z vody. Po vyslechnutí příběhu pošle Mary stránku k modlitbě. Přiznává se Bohu, že už nemá sílu odolat její lásce k Botwellovi. Královna ví, že u soudu je považována za zamilovanou do Riccia. Riccio vstoupí. Mary hlásí smrtelné nebezpečí, které ho ohrožuje a chladně se s ním rozloučí a nasměruje ho na loď, která ho zavede do Říma. V zoufalství se Riccio snaží prosit královnu, aby zrušila rozhodnutí opustit. Královna je neústupná.
Heinrich, Morton a Lindsay se dozvěděli o Riccioho blížícím se odjezdu a rychle uspěchali, aby ho zabili nebo nechali plavit. Pak se objeví Douglas a hlásí, že Riccio již vyplul. Douglas v zoufalství touží po krvavé pomstě, jeho rytířská čest je zraněná. Najednou se setkají se stránkou, která přináší královně notu od Riccia - neodešel a bude s ní večer. Spiklenci vezmou poznámku.
Maria je zaneprázdněna vyšíváním ve svém pokoji. Riccio, který přišel, jí vysvětluje, že nemůže odejít, protože ráno má douglaska s Douglasem. Přiznává, že život bez její lásky nepotřebuje. Požádá Marii, aby mu věnovala věnec z růží - na oltář v Římě vysadí květiny ... Henry, Douglas a Dindsay přijdou a zabijí Riccia. Královna omdlí. Douglas je zasažen ostudou a hrůzou - dobrovolně odchází do exilu. Henry se bojí, jestli ho královna nenávidí. Lindsay krále odvezla a zašeptala mu o nadcházejícím lovu. Queen Botwell je pozvána královnou. Mary přichází k jejím smyslům, vidí Botvela a vyznává mu jeho lásku. Botvel ji nutí připustit, že chce Henryho smrt, a dá jí lahvičku jedu s tím, že je to prášek na spaní. Marie dává králi tento „lék“, ale jed pije buvola. Vražednou intriku však nemůže zastavit nic - Botwell vyhodí dům krále Jindřicha. V dálce jsou slyšet rostoucí výkřiky davu. Botvel s královnou se skrývají.